Μικροβιολογία Τροφίμων με FT-IR: η αναζήτηση της ισορροπίας…

Γενικά
Οι μικροοργανισμοί δεν είναι μόνο ιδιαίτερα ουσιώδης παράγοντας για την παραγωγή τροφίμων όπως τα γαλακτοκομικά, το ψωμί, η μπύρα και το κρασί, αλλά παίζουν και κύριο ρόλο στις σύγχρονες βιομηχανικές διαδικασίες όπως η ζύμωση ενζύμων, βαφών, αντιοξειδωτικών κτλ, ενώ παράλληλα αυξάνουν την πεπτικότητα και σταθερότητα των τροφίμων. Παρόλα αυτά, οι μικροοργανισμοί μπορούν να προκαλέσουν σοβαρά προβλήματα στην παραγωγή όπως αλλοίωση ή ακόμα και δηλητηρίαση. Μία αποτελεσματική διαχείριση της μικροβιακής ποιότητας είναι καίρια για την ασφάλεια των προϊόντων. Ο αξιόπιστος προσδιορισμός των μικροοργανισμών επιτρέπει την βελτιστοποίηση των παραγωγικών διαδικασιών και την ανίχνευση πηγών επιμολύνσεων.

Μέθοδος
Η Φασματοσκοπία Υπερύθρων με Μετασχηματισμό Φουριέ (FT-IR) έχει ήδη καθιερωθεί ως μια γρήγορη και οικονομικώς αποδοτική μέθοδος σε πολλούς τομείς της ανάλυσης τροφίμων. Ποιοτικές δοκιμές, όπως ο έλεγχος των πρώτων υλών, καθώς και ποσοτική αξιολόγηση των πολύπλοκων συνθέσεων είναι εφικτές με την τεχνική αυτή. Στον τομέα της μικροβιολογίας ένα φάσμα FT-IR αποκαλύπτει το δακτυλικό αποτύπωμα των μικροοργανισμών. Η μορφολογία του περιλαμβάνει τα δονητικά χαρακτηριστικά των συστατικών κυττάρων, όπως κυρίως πρωτεΐνες, λιπίδια, DNA / RNA και υδατάνθρακες (Εικ. 1). Ως εκ τούτου ένα φάσμα FT-IR είναι σαν ένα χαρακτηριστικό δακτυλικό αποτύπωμα από έναν οργανισμό. Η υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια της μέτρησης διευκολύνει τον προσδιορισμό μικροοργανισμών ακόμα και σε επίπεδο στελέχους.

 

Εικόνα 1: Τυπικό φάσμα FT-IR βακτηριδίου. Υποδεικνύονται φασματικές περιοχές που κυριαρχούνται από μπάντες ορισμένων συστατικών των κυττάρων.

Το παρόν άρθρο στηρίζεται σε δοκιμές και μετρήσεις με εξοπλισμό που έχει αναπτυχθεί από μία από τις σημαντικότερες εταιρίες κατασκευής τέτοιων συστημάτων, την BRUKER. Η εταιρία έχει αναπτύξει εξοπλισμό που επιτρέπει τόσο τον εύκολο όσο και αξιόπιστο προσδιορισμό μικροοργανισμών, σε συνδυασμό πάντα με το ισχυρότατο λογισμικό των οργάνων αυτών αλλά και τις μεθόδους – βιβλιοθήκες που αναπτύσσονται σε συνεργασία με σημαντικότατους επιστημονικούς φορείς του τομέα.

Προετοιμασία Δείγματος και Μέτρηση
Λίγες μόνο ώρες εκπαίδευσης απαιτούνται για να αποκτήσει κανείς πλήρη κατανόηση και ικανότητα για την προετοιμασία του δείγματος και μόνο λίγα δευτερόλεπτα για να προετοιμαστεί κάθε δείγμα για μέτρηση.

Η προετοιμασία του δείγματος περνάει από τρία βήματα. Καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών αναπτύσσονται για 24 ώρες κάτω από τυπικές συνθήκες. Ορισμένες αποικίες συλλέγονται από την πλάκα (τρυβλίο με άγαρ) και δημιουργούμε εναιώρημα σε απεσταγμένο νερό. Το εναιώρημα αυτό τοποθετείται σε ειδικές επαναχρησιμοποιήσιμες μικροπλάκες με 96 ή 384 θέσεις (Εικ. 2). Σε αντίθεση με άλλες μεθόδους δεν χρειάζεται κανένα άλλο χρονοβόρο στάδιο καλλιέργειας. Μετά από ξήρανση (περίπου 15 λεπτά) η πλάκα εισάγεται μέσα στην συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (HTS-XT). Δεν απαιτούνται αντιδραστήρια ή άλλα αναλώσιμα για την μέτρηση. Η λήψη δεδομένων καθώς και η αξιολόγησή τους γίνονται αυτόματα (Εικ. 3). Κάθε δείγμα μετράται και προσδιορίζεται μέσα σε περίπου ένα λεπτό. Οι μικροπλάκες μπορούν εύκολα να καθαρίζονται και να επαναχρησιμοποιούνται. Τα αποτελέσματα ταυτοποίησης συνοψίζονται σε ένα πίνακα που δείχνει το εντοπισμένο στέλεχος ή τα είδη, καθώς και την ποιότητα της μέτρησης (Εικ. 4).

Εικόνα 2: Πλάκες δείγματος διαθέσιμες σε μορφή 96 και 384 θέσεων. Οι πλάκες καθαρίζονται εύκολα και επαναχρησιμοποιούνται.

Εικόνα 3: Το λογισμικό παρέχει αυτόματη μέτρηση, έλεγχο ποιότητας δεδομένων, αξιολόγηση δεδομένων και δημιουργία αναφορών.

Εικόνα 4: Σε κάθε μέτρηση δημιουργείται μία λίστα με τα είδη ή τα στελέχη με τις περισσότερες ομοιότητες με το υπό εξέταση δείγμα. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται σε ένα πίνακα, όπου οποιαδήποτε αποτυχία στην ποιότητα των φασμάτων υποδεικνύεται σε χωριστή στήλη.

Βάσεις Δεδομένων
Η ποιότητα των βάσεων δεδομένων είναι θεμελιώδους σημασίας για την αξιόπιστη ταυτοποίηση. Το φάσμα εκάστου αγνώστου μικροοργανισμού συγκρίνεται έναντι όλων των φασμάτων της βάσης. Ως εκ τούτου, μια πλήρης βιβλιοθήκη πρέπει να καλύπτει όλα τα σχετικά είδη, αλλά επίσης και τις φασματικές διακυμάνσεις των διαφόρων στελεχών από ένα είδος. Αυτό επιτρέπει την ταυτοποίηση μικροοργανισμών, ακόμη και κάτω από το επίπεδο είδους. Στις υφιστάμενες βάσεις δεδομένων μικροοργανισμών σχετιζόμενων με τρόφιμα όχι μόνο τα στελέχη από τα αποθέματα αναφοράς περιλαμβάνονται, αλλά και μικροοργανισμών από διάφορες μονάδες παραγωγής. Με την προσθήκη δειγμάτων από περιβάλλοντα συγκεκριμένων προϊόντων (product specific habitats) βελτιώθηκε περαιτέρω η στιβαρότητα και η αξιοπιστία της μεθόδου. Όλοι οι μικροοργανισμοί ταυτοποιήθηκαν με αξιόπιστες μεθόδους αναφοράς πριν την προσθήκη τους στις βιβλιοθήκες.

Οι υπάρχουσες βάσεις δεδομένων δημιουργήθηκαν και επικυρώθηκαν από το:

• Technical University Munich,
• Zentralinstitut fόr Ernδhrungs- und Lebensmittelforschung
• Weihenstephan (ZIEL, Munich, Germany),
• Department of Microbiology (Prof. Dr. Scherer).

Χρησιμοποιούνται εκεί για τη συνήθη αναγνώριση για αρκετά χρόνια. (κατάλογος βιβλιοθήκης βλ. Εικ. 5).

Τα αποτελέσματα εκδίδονται από το λογισμικό σε μια βολική μορφή πίνακα. Το λογισμικό του συστήματος επιτρέπει επίσης να απεικονίζουν τις ομοιότητες των φασμάτων των διαφορετικών μικροοργανισμών γραφικά στην μορφή ενός δενδρογράμματος.

Εικόνα 5: Βιβλιοθήκες για μικροοργανισμών σχετικών με τα τρόφιμα.

Περαιτέρω εφαρμογές
Σε εταιρείες παραγωγής τροφίμων, η ανάλυση και ο χαρακτηρισμός των μικροβιακών πληθυσμών είναι ένα σημαντικό μέρος της διαχείρισης της ποιότητας. Η ευκολία της χρήσης και η σχέση κόστους απόδοσης σε συνδυασμό με τα γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα, καθώς και τη δυνατότητα να διαφοροποιήσουν σε επίπεδο στελεχών καθιστά την ανωτέρω μέθοδο ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την παρακολούθηση της ενδημική χλωρίδα κάθε εργοστασίου παραγωγής. Η συγκεκριμένη βιβλιοθήκη ενδημικής χλωρίδας μπορεί να βοηθήσει για:

• Εντοπισμό διαδρομής μικροβιακών επιμολύνσεων
• Συγκεκριμένο έλεγχο καλλιεργειών
• έγκαιρη αναγνώριση των αλλαγών στη χλωρίδα
• Βελτιωμένη αντιμετώπιση προβλημάτων (ανίχνευση της πηγής / υπαιτιότητες της μόλυνσης)
• Βελτιωμένη παρακολούθηση της υγιεινής

Προσδιορισμός Μικροοργανισμών σε Τρόφιμα με FT-IR – Αποδοτικότητα και οικονομία

• Όχι αναλώσιμα ή αντιδραστήρια
• Ελάχιστη συντήρηση
• Αναγνώριση σε επίπεδο στελεχών
• Πλήρεις βιβλιοθήκες για μικροοργανισμούς σχετικούς με τα τρόφιμα
• Ευρέως εφαρμόσιμη
• Βιβλιοθήκη αναπτύξιμη και διαμορφώσιμη από τον πελάτη
• Ολοκληρωμένη διαχείριση δεδομένων
• Ελάχιστη ανάγκη χειρισμών – εξοικονόμηση χρόνου
• Γρηγορότερη από άλλες μεθόδους ταυτοποίησης (μόνο ένα βήμα καλλιέργειας)

Μιχάλης Δ. Κοκοζίδης – Φυσικός, MSc Microelectronics
Ειδικός Τεχνικός Επιστημονικών Οργάνων & Ανάλυσης Εφαρμογών
InterActive S.A.
www.interactive.com.gr 
e-mail : esales@interactive.com.gr

Η εταιρία InterActive ΑΕ αντιπροσωπεύει τα φασματόμετρα και μικροσκόπια υπερύθρου και Raman της BRUKER σε Ελλάδα και Κύπρο για πάνω από 20 χρόνια, με προσωπικό άρτια καταρτισμένο ώστε να μπορεί να παρέχει ολοκληρωμένες λύσεις στις ανάγκες των πελατών της. Πέραν των φασματομέτρων της BRUKER, η εταιρία διαθέτει μία μεγάλη πλειάδα λοιπών εργαστηριακών οργάνων. Στον εκτενέστατο κατάλογο, περιλαμβάνονται και Κλιματικοί Θάλαμοι (environmental), Επωαστικοί κλίβανοι (Incubators), Θάλαμοι Φωτοσταθερότητας και αντίστοιχα υλικά (τρυβλία, ράφια κτλ) της εταιρίας CARON.